Otto Piene leistete zunächst Kriegsdienst und studierte von 1949 bis 1950 Malerei und Kunsterziehung an der Akademie der Bildenden Künste in München und von 1950 bis 1953 an der Kunstakademie in Düsseldorf. Von 1951 bis 1964 war er als Dozent an der Modeschule Düsseldorf, außerdem studierte er in den 1950er Jahren Philosophie. 1957 gründete Piene zusammen mit Heinz Mack die Künstlergruppe ZERO, der sich 1961 auch Günther Uecker anschloss, außerdem veröffentlichten sie bis 1961 die gleichnamige Zeitschrift. Die Idee von ZERO war ein kompletter Neubeginn der Malerei von einem Nullpunkt aus. Wichtig dafür waren Bewegung und Licht und für Piene auch Feuer. Bekannt sind seine Lichtballette und Rauchbilder. Von 1961 bis 1966 veranstaltete ZERO zahlreiche Ausstellungen und zeigte auf der documenta 3 den „Lichtraum“, eine Gemeinschaftsarbeit der drei Künstler.
1995 wurde seine erste Einzelausstellung gezeigt.

1964 war er als Gastprofessor an der University of Pennsylvania und von 1963 bis 1971 Fellow am Center for Advanced Visual Studies (CAVS). Seine erste Retrospektive wird 1967 am Museum Ostwall in Dortmund gezeigt. 1972 wurde Piene Professor für Visual Design for Environmental Art am Massachusetts Institute of Technology (M.I.T.) und von 1974 bis 1994 Direktor des CAVS.
2008 gründete Piene zusammen mit Heinz Mack, Günther Uecker und der Stiftung Museum Kunstpalast die ZERO foundation, die das Ziel hat die ZERO-Bewegung zu erhalten, präsentieren und erforschen.
Piene war Mitglied im Deutschen Künstlerbund und erhielt zahlreiche Auszeichnungen, wie das Verdienstkreuz 1. Klasse der Bundesrepublik Deutschland; außerdem wurde ein Asteroid nach ihm benannt.

Bekannte Werke
• Hell Gelb Hell, 1958, LWL-Landesmuseum für Kunst und Kulturgeschichte, Münster
• ZERO Lichtraum, 1964, Museum Kunstpalast, Düsseldorf
• Glasdach, 1970, Universität Konstanz
• Geleuchtet, 2006, Lichtinstallation, Moers, Halde Rheinpreußen